大球盖菇菌种生产方法和蘑菇、草菇菌种生产方法基本相同，可用组织分离法和孢子分离法获得纯菌种，新区主要靠引进母种或原种。适合大球盖菇母种生产的培养基如下：
大球盖菇母种培养基
（1）麦芽糖酵母琼脂培养基（MYA）大豆蛋白胨（豆胨)1克、酵母2克、麦芽糖20克、琼脂20克，加水至1000毫升。
（2）马铃薯葡萄糖酵母琼脂培养基（PDYA）马铃薯300克（加水1 500毫升，煮20分钟，用滤汁）、酵母2克、豆胨1克、葡萄糖10克、琼脂20克，加水至1 000毫升。
（3）燕麦粉麦芽糖酵母琼脂培养基（DMYA）燕麦粉80克、麦芽糖10克、酵母2克、琼脂20克，加水至1 000毫升。
上述3种配方中如不加琼脂，即可作为液体培养基。以上培养基需按常规配制、分装、灭菌、接种和培养。
大球盖菇原种和培养基
（1）小麦秆或裸麦秆，切碎（长2～3厘米），泡湿，装瓶，高压灭菌后备用。
（2）小麦、裸麦，高粱、玉米、小米等谷粒浸泡，煮透至没有白芯但表皮不破，加2%碳酸钙，装瓶，高压灭菌后备用。
（3）木屑和小木片各40%、麸皮20%，制作栽培种培养基。
还可用平菇或金针菇下脚料作培养基重新灭菌后备用。
大球盖菇接种
可以用培养3～4天的液体菌种接种。若用固体菌种必须加大接种量（菌种/培养料），接种量最少10%，最好15%～20%。
大球盖菇培养
接种后，把菌种瓶或袋放在20～28℃培养室中培养。大球盖菇菌丝生长几天后，菌丝生长速度会逐渐缓慢，加速菌丝生长的方法是搅拌。用液体菌种接种的无菌麦粒培养基，每隔3～7天摇瓶一次，把菌丝摇断，可以刺激菌丝再生，能保证菌丝生长旺盛。